kryokonfokales Lichtmikroskop

Unser Ziel ist die Untersuchung makromolekularer Strukturen in nativen, gefrorenen zellulären Umgebungen ("in situ") mittels Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET). Integrale Bestandteile des Arbeitsablaufs der Kryo-ET am Helmholtz Zentrum München (HMGU) sind ein kryogenes focused ion beam Rasterelektronenmikroskop (cryo-FIB/SEM, Aquilos) und ein hochauflösendes 300kV-Kryo-Transmissionselektronenmikroskop (cryo-TEM, Krios G4) der Firma ThermoFisher Scientific. Die Kryo-ET ist für viele Aspekte der Gesundheitsforschung am Helmholtz Zentrum München (HMGU) von entscheidender Bedeutung und schlägt eine Brücke von der atomaren Auflösung spezifischer Komplexe zur zellulären Bildgebung. Unsere Kryo-ET-Studien erfordern zusätzlich zum bereits bestehenden Arbeitsablauf eine präzise Lokalisierung zellulärer Strukturen mit Hilfe eines für die kryokorrelative licht- und elektronenmikroskopische Bildgebung und das korrelative 3D-Kryo-FIB-Fräsen optimierte (Cryo-CLEM) konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (cryo-CLSM). Um dynamische Aktinstrukturen, wie z.B. kleine endozytische Einstülpungen, Aktinringe/-käfige (< 50 nm im Durchmesser), die während der Ferroptose gebildet werden oder Aktinanordnungen, die durch Pathogene wie EPEC-Sockel induziert werden, zu erfassen, ist die bestmögliche laterale und axiale Auflösung nötig. Dies erfordert ein cryo-CLSM, das, mit dem Einsatz computergestützter Dekonvolution, laterale (xy) Auflösungen von 120 nm und axiale (z) Auflösungen von 200 nm liefern kann. Wir verwenden eine Vielzahl von Fluoreszenzsonden, darunter GFP/sfGFP/EGFP/mNeonGreen, mRFP/mCherry/mScarlet/Propidiumjodid (PI), DAPI/Hoechst und YFP, und müssen oft neue Kombinationen von Fluorophoren erproben, um das Fluoreszenzsignal unserer Proben unter Kryobedingungen zu optimieren. Das Spektrum des sichtbaren Lichts umfasst ungefähr einen Wellenlängenbereich zwischen ca. 400 und 780 nm. Da jedes Fluorophor und jedes fluoreszierende Protein mindestens eine Wellenlängenbande von 100 nm benötigt, ist die Visualisierung mehrerer Ereignisse oder Komponenten mit der konfokalen Mikroskopie durch die Anzahl der synthetischen Fluorophore oder fluoreszierenden Proteine begrenzt, die gleichzeitig abgebildet werden können, ohne dass es aufgrund signifikanter spektraler Überschneidungen zu Bleed-Through-Artefakten kommt. Bei der Verwendung von EGFP und EYFP beispielsweise regt die 488-nm-Laserlinie eines herkömmlichen Konfokalsystems beide Fluoreszenzproteine gleichzeitig an. Daher ist für Experimente mit diesen Fluoreszenzsondenkombination eine andere Lösung erforderlich. Darüber hinaus sind die meisten konfokalen Systeme durch die Anzahl und Spezifität der verfügbaren Anregungslinien, Filter und Detektoren eingeschränkt. Außerdem führt die niedrige Temperatur unter kryogenen Bedingungen dazu, dass Anregungs- und Emissionsspektren konvergieren, was eine zuverlässige Trennung erschwert. Um Fluorophore besser trennen zu können benötigen wir ein flexibles Lasersystem, das ein Spektrum von 485 bis 685 nm in 1-nm-Schritten anregen kann. Das System muss zudem in der Lage sein die unterschiedliche Lebensdauer von Fluorophoren zu differenzieren, um die Trennung von Fluorophoren weiter zu erleichtern. Die Verwendung eines Superkontinuum-Weißlichtlasers ermöglicht es uns, jede beliebige Wellenlänge auszuwählen, die wir zur Anregung unserer Proben benötigen, und den Bereich der zugänglichen Fluorophore auf das nahe Infrarot und das blaue Spektrum zu erweitern. Mit der Kombination aus Weißlichtlaser und Erfassung der Lebensdauer der Fluorophore können starke Autofluoreszenzsignale, von z.B. Elektronenmikroskopie-Gittern, entfernt werden. Sie ermöglicht es ebenso, Fluorophore mit erheblicher spektraler Überlappung auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Lebensdauer verschiedenen Kanälen zuzuordnen und sie somit als getrennte Bilder zu visualisieren, die von den im gleichen spektralen Erfassungsfenster gesammelten Photonen stammen (Roberti, M.J., Lopez, L.O., Ossato, G